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烏拉爾甘草優良品系選育研究(Ⅰ)
發布者:admin 發布時間:2009/4/17 16:21:53 閱讀:


烏拉爾甘草優良品系選育研究
()
——四個來源甘草遺傳基礎的AFLP分析
周成明1  許彬12  張金屯2﹡ 高文遠3
(1.北京時珍中草藥技術有限公司, 北京 102609; 2. 北京師范大學生命科學學院, 北京 100875;3.天津大學藥物科學與技術學院,天津 300072)
 
摘  要:采用擴增片段長度多態性(AFLP)標記技術對烏拉爾甘草栽培新品系“民勤1號”、“喀什1號”、常規栽培品系內蒙古烏拉爾甘草和脹果甘草進行遺傳基礎分析,在UPGMA聚類中被劃分為四組,指紋圖譜顯示出“民勤1號”、“喀什1號”分別具有的特異性譜帶數量分別為6條和2條。結果表明 “民勤1號”、“喀什1號”形成了獨特的基因構成,可以作為烏拉爾甘草優良栽培新品系。
關鍵詞:烏拉爾甘草;良種選育;AFLP;指紋圖譜
Study on Selective Breeding of Glycyrrhiza uralensis ()
——AFLP analysis for Glycyrrhiza
 
    ZHOU Cheng-ming1  XU Bin12  ZHANG Jin-tun2  GAO Wen-yuan3
(1. Beijing Shizhen herbal medicine technology Ltd.,Beijing 102609, China; 2. College of Life Science of Beijing Normal University, Beijing 100875, China; 3.The College of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China)
AbstractAFLP was used to evaluate the genetic polymorphism of new breed of Glycyrrhiza uralensis “Minqin No.1”, “Kashi No.1”, usual cultivar Nei Mongglo and Glycyrrhiza inflata Bat. Cluster results showed that all the populations studied were clustered into 4 groups, and fingerprinting showed the peculiar boot of the 2 new breeds were 6 and 2. The results showed that “Minqin No.1”, “Kashi No.1” have inimitable gene structure, and should be used as new breed.
Key words: Glycyrrhiza uralensis; selective breeding; AFLP; DNA fingerprinting
 
      豆科(Leguminosae)甘草屬(Glycyrrhiza Linn)植物中有3種甘草入藥,即烏拉爾甘草、脹果甘草、光果甘草[1]。目前只有烏拉爾甘草進行引種大面積栽培,每年產量已達萬噸,暢銷國內外市場。但目前栽培甘草產品存在單位面積產量、甘草酸含量偏低的問題,許多栽培專家在栽培技術上進行了一系列的研究[234],但該問題沒有得到很好的解決,主要原因之一是目前還沒有選育出農藝性狀和品質優良并能夠在栽培中進行推廣的品系。我們從2001年開始進行烏拉爾甘草優良品系的選育研究,在甘肅民勤選育出具有優良性狀的烏拉爾甘草栽培新品系,命名為“民勤1號”,其優良性狀表現為植株抗逆性強,越冬芽數量較多,株型好,栽培三年生植株開花、結籽數量多,主根長、直、分叉少,根頭直徑粗壯,栽培三年生甘草酸含量達到3%以上,單株鮮重平均達到100克,畝產(667m2)根鮮重達到2500公斤,比常規栽培品系內蒙古烏拉爾甘草要高出1000公斤左右,2005年擴繁了100公頃。2004年我們又在新疆的喀什選育出一個優良栽培新品系,命名為“喀什1號”目前已經擴繁了200公頃。
      AFLP擴增片段長度多態性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)結合了RFLP和PCR的優點[5],既具有RFLP可靠性好、重復性高的特點,同時又具有PCR的高效性、安全性和方便性[6],重復性比RAPD好,被廣泛地應用于植物遺傳育種方面的研究。
      為了確認烏拉爾甘草栽培新品系“民勤1號”、“喀什1號”與目前常規栽培品系內蒙古甘草和脹果甘草在遺傳本質上是否有所不同,本文應用AFLP技術對以上四個來源烏拉爾甘草進行遺傳基礎分析。
1 材料與方法
1.1 材料
      試驗所用材料為烏拉爾甘草栽培新品系“民勤1號”、“喀什1號”、常規內蒙古烏拉爾甘草和脹果甘草種子,種子由北京時珍中草藥技術有限公司周成明采集鑒定。取干種子常規發芽,每種材料分別取10株胚根,混為一份樣品,提取DNA組織。
1.2 DNA組織提取
    采用CTAB法提取[7] 
1.3 AFLP分析
     模板DNA的酶切、連接、預擴增和選擇性擴增的反應液配方和反應程序由北京鼎國生物公司設計進行。
1.4 AFLP圖譜分析
應用ABI 377測序儀進行AFLP多態性分析。
1.3 數據處理
    將電泳圖譜上清晰可見且可重復出現的條帶記為“1”,同一位置沒有出現的帶記為“0”,
生成由“1”和“0”組成的原始矩陣。計算多態性位點百分率(p): p=(k/n)×100%,其中k是多態位點數目;n為所測位點總數。用AFLP-SURV 1.0 (Vekemans et al . , 2002)軟件計算每個居群的多態位點數, 多態位點百分率。以Jaccard 相似系數為參數用NTSYSpc 2. 0 (Rohlf ,1997) 對40個烏拉爾甘草樣品用非加權配對算術平均的方法(Unweighted pair-group method with arithmetic mean , UPGMA) 進行聚類分析。
2   
2.1 AFLP分析的引物篩選及其標記的多態性
      由此對EcoR I標記引物E-AAC、E-AAG、E-ACA、E-ACT、E-ACC、E-ACG、E-AGC、E-AGG(8個)和Mse I 標記引物M-AA、M-AC、M-AG、M-AT、M-TA、M-TC、M-TG、M-TT(8個)完全排列組成的64個引物組合進行篩選,從中選出了8個譜帶清晰、帶型分布均勻并且多態性高的引物組合,共擴增出1025條帶譜,平均每個引物擴增出128條。8對引物共擴增出多態性帶540條,多態位點百分率為52.7%,其中44條帶為40個樣品所共有,平均每對引物擴增出67.5條多態性帶(表1)。
 
1 適宜于甘草AFLP分析的8個引物組合序列及其擴增結果
Table 2 The base sequence of 8 primer combinations for AFLP analysis; and AFLPs generated among 40 individuals using the eight combinations
引物組合
Primer combination
引物序列
Prime sequence(5′-3′)
總位點數
Total bands
多態位點數
Polymorphic bands
多態位點百分率
Polymorphism( %)
E-AAC/M-CAA
GACTGCGTACCAATTCAAAC
GATGAGTCCTGAGTAACAA
129
68
52.7
E-AAC/M-CAG
GACTGCGTACCAATTCAAAC
GATGAGTCCTGAGTAACAG
144
80
55.6
E-AAC/M-CTC
GACTGCGTACCAATTCAAAC
GATGAGTCCTGAGTAACTC’
137
69
50.4
E-AAG/M-CAA
GACTGCGTACCAATTCAAAG
GATGAGTCCTGAGTAACAA
111
59
53.2
E-AAG/M-CAG
GACTGCGTACCAATTCAAAG
GATGAGTCCTGAGTAACAG
143
75
52.4
E-AAG/M-CTC
GACTGCGTACCAATTCAAAG
GATGAGTCCTGAGTAACTC
138
72
52.2
E-AAG/M-CTT
GACTGCGTACCAATTCAAAG
GATGAGTCCTGAGTAACTT
113
56
49.6
E-ACT/M-CTC
GACTGCGTACCAATTCAACT
GATGAGTCCTGAGTAACTC
110
61
55.4
總計/平均
 
1025/128
540/67.5
--/52.7
 
2.2 指紋圖譜構建
      在篩選出的8對引物組合中,E-AAC/M-CAG組合共擴增出144條帶譜,擴增的DNA片段在50bp~450bp之間,其中多態性帶譜為80條,共有帶64條,多態位點百分率達到了55.6%,為各引物中最高。特異性譜帶8條,其中“民勤1號”具有的特征譜帶數為6條( 74bp,95bp,113bp,167bp,258bp,300bp),“喀什1號”具有的特異性譜帶數為2條(89bp,357bp);脹果甘草和內蒙古烏拉爾甘草相比具有5條(98bp,106bp,113bp,171bp,184bp)特異性譜帶。因此,該引物組合具有較強的檢測不同甘草基因型間遺傳變異差異性的能力,用以構建“民勤1號”、“喀什1號”、內蒙古對照和脹果甘草對照的指紋圖譜(圖1)。
Ⅰ:內蒙古烏拉爾甘草對照;Ⅱ:脹果甘草對照; Ⅲ:喀什1號; Ⅳ:民勤1號
1 基于引物組合E-AAC/M-CAG的四個來源甘草AFLP指紋圖譜
Fig.1 AFLP fingerprinting amplified with primer E-AAC/M-CAG
 
2.3 聚類分析
      依據以上8對引物所擴增出的四個來源甘草的1025個DNA帶譜的數據,按照Jaccard 相似性系數進行UPGMA聚類,構建供試材料間的親緣關系樹狀圖(圖2)。
由圖中可以看出,四個來源甘草被聚為兩組。其中,在0.61處“民勤1號”被分出;在0.65處其他三份樣品聚在一起。在0.67處脹果甘草和“喀什1號”被聚為一支,在0.68處內蒙古對照被分離。結果表明,脹果甘草與“喀什1號”親緣關系最近,內蒙古對照和脹果甘草、“喀什1號”之間親緣關系也較近,而“民勤1號”與另外三種親緣關系較遠。
 
3   
      植物在生長過程中,由于自然雜交,基因突變,以及外界惡劣環境條件的長期影響等多種原因,在基因構成上會產生不同程度的變異,而這種變異正是進行作物新品種選擇的基礎。 
  
1-c10:內蒙古對照; c11-c20:脹果甘草對照; c21-c30:喀什1號; c31-c40:民勤1號
2  基于AFLP 數據的40份甘草種質的UPGMA 聚類圖
Fig. 2 Dendrogram illustrating the genetic relationships among 40
Glycyrrhiza L. accessions based on UPGMA cluster analysis of AFLP data
 
“民勤1號”、“喀什1號”、脹果甘草分別采集于甘肅、新疆等地的野生種群,我們在對其進行引種栽培和優良品系選育的過程中,發現與常規人工栽培品系內蒙古烏拉爾甘草相比,在單位面積產量、抗性、產品品質等方面具有顯著的優勢。  
      UPGMA聚類圖表明四種來源甘草被劃分為四組,并表現出不同遠近的親緣關系;指紋圖譜顯示出“民勤1號”、“喀什1號”具有的特異性譜帶數量分別為6條和2條。說明由于受到惡劣生長環境的長期影響,兩個不同來源烏拉爾甘草經過較長時期的演變之后,已經各自形成了其獨有的基因結構。因此我們可以確定經過多年選育的“民勤1號”、“喀什1號”可以作為烏拉爾甘草優良栽培新品系進行進一步的推廣。
 
 
References
[1]  中華人民共和國藥典第一部,2005版:65-68
[2]  Zhou C M, Kong X F. A Study on Cultivation Technigues for Glycyrrhiza uralensis Fisch. in Daxing County Area,Beijing[J]. China Journal of Chinese Materia Medica(中國中藥雜志),2000,25(3):140-143
[3]  Zhou C M. the outline of the normative Cultivation Technigues for Glycyrrhiza uralensis Fisch.[J]. Research& Information on Traditional Chinese Medicine(中藥研究與信息). 2003,5(2):25-28
[4]   Zhou C M. Cultivation Technigues for Glycyrrhiza uralensis Fisch.[J]. Xinjiang Farmland Reclamation Science & Technology. 2006(1):14-15
[5]  Vos P, Hogers R, Bleeker M, et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting[J]. Nucleic Acids Research, 1995,23(21):4407-4414
[6]  Sun Q L, Liang Y R, Ding Z T, et al. AFLP molecular marker technique and its application to tea Genetic and breeding research[J]. Journal of Tea(茶葉),2004,30(4):203-206
[7]  Doyle JJ , Doyle JL , 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue [J ] . Focus , 12 (1) : 13 -15


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