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烏拉爾甘草優良品系選育研究(Ⅱ)
發布者:admin 發布時間:2009/4/17 16:25:56 閱讀:

烏拉爾甘草優良品系選育研究(

——甘草屬五種不同來源植物遺傳基礎的AFLP分析

 周成明[1],庾曉紅1高文遠2

1.北京時珍中草藥技術有限公司, 北京 102609; 2.天津大學藥物科學與技術學院,天津 300072

   : 目的 研究甘草屬五種不同來源的植物的遺傳基礎,探討AFLP分子標記技術在烏拉爾甘草優良栽培品系選育中的應用以及甘草屬五種不同來源的植物的親緣關系。 方法 采用擴增片段長度多態性(AFLP)標記技術對烏拉爾甘草栽培新品系“阿勒泰1號”、“烏什1號”和常規栽培品系內蒙古烏拉爾甘草以及脹果甘草、光果甘草進行基因組DNA多態性、指紋圖譜和UPGMA聚類分析 結果 64對引物組合中篩選出了15對引物組合進行多態性分析,以多態位點百分率最高的E-AGG/M-CAA組合構建甘草屬五種植物不同來源的指紋圖譜。UPGMA聚類分析將五種不同來源的植物分為兩組,表現出不同的親緣關系。結論 “阿勒泰1號”、“烏什1號”形成了獨特的基因構成,可以作為烏拉爾甘草優良栽培新品系選育目標進行深入研究;內蒙古產烏拉爾甘草與光果甘草的親緣關系最近。

關鍵詞:烏拉爾甘草,光果甘草,脹果甘草;良種選育;AFLP;指紋圖譜

Study on Selective Breeding of Glycyrrhiza uralensis ()

——AFLP analysis for genus Glycyrrhiza

ZHOU Cheng-ming1, Yu Xiao-hong1, GAO Wen-yuan3

(1. Beijing Shizhen herbal medicine technology Ltd., Beijing 102609, China; 2. The College ofPharmaceutical Science and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China)

Abstract: Object Studies on genetic background of Glycyrrhiza and the application of amplified fragment length polymorphism (AFLP) to the select of breeding of Glycyrrhiza uralensis and relative relationships of different species in genus Glycyrrhiza. Methods The DNA polymorphism, fingerprinting, and UPGMA analysis of different species in genus Glycyrrhiza from Aletai, Wushi and Inner Mongolia were detected by AFLP technique. Results 15 primer combinations were screened from 64 primer combinations to analysis DNA polymorphism and the DNA fingerprinting were generated by primer combination E-AGG/M-CAA. UPGMA analysis showed that all the studied populations were clustered into two groups and have different relative. Conclusion The results showed that “Aletai No.1”, “Wushi No.1” have inimitable gene structure and should be studied more as new breed resource. On the other hand, Glycyrrhiza uralensis produced in Inner Mongolia is relative of Glycyrrhiza glabra.

Key words: Glycyrrhiza uralensis; Glycyrrhiza inflata; Glycyrrhiza glabra; selective breeding; AFLP; DNA fingerprinting

上篇論文主要研究了烏拉爾甘草栽培優良品系“民勤1號”的遺傳基礎及品系內的親緣關系[1]。本論文主要研究烏拉爾甘草栽培新品系“阿勒泰1號”的遺傳基礎及與甘草屬內植物的親緣關系。由于數十年來人工大量的采挖野生烏拉爾甘草,導致內蒙古主產區烏拉爾甘草種源急劇減少,種籽質量降低,無法滿足大面積栽培需要。我們從2002年開始采集內蒙古以外地區的烏拉爾甘草種源進行大面積栽培并選育優良栽培新品系,從中發現“阿勒泰1號”,根系發達,主根直、長,根皮淡紅色,地上植株矮小緊湊,適合密植。在甘肅酒泉栽培3年每公頃產量約30000公斤鮮根,比內蒙古烏拉爾甘草產量每公頃產量約高4500公斤,甘草酸含量超過2%。目前,我公司已推廣約4000公頃“阿勒泰1號”。“烏什1號”葉小,莖桿直立,抗到伏,正在選育過程中。

為了確認烏拉爾甘草栽培新品系“阿勒泰1號”、“烏什1號”與常規內蒙古產烏拉爾甘草在遺傳本質上是否有所不同,以及不同栽培品系的烏拉爾甘草與光果甘草及脹果甘草的親緣關系,本文應用AFLP技術[23]對甘草屬以上五種不同來源的植物進行遺傳基礎分析。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用材料為常規內蒙古產烏拉爾甘草、烏拉爾甘草栽培新品系阿勒泰1烏什1、光果甘草和脹果甘草種子。種子由北京時珍中草藥技術有限公司周成明采集鑒定。取干種子常規發芽,每種材料分別取10株胚根,混為一份樣品,提取DNA組織。

1.2 DNA組織提取

    采用CTAB法提取[4] 

1.3 AFLP分析

模板DNA的酶切、連接、預擴增和選擇性擴增的反應液配方和反應程序由北京鼎國生物公司設計進行。

1.4 AFLP圖譜分析

應用ABI 377測序儀進行AFLP多態性分析。

1.5 數據處理

    將電泳圖譜上清晰可見且可重復出現的條帶記為“1,同一位置沒有出現的條帶記為“0,生成由“1和“0組成的原始矩陣。計算多態性位點百分率(p): p=(k/n)×100%,其中k是多態位點數目;n為所測位點總數。用AFLP-SURVEY 1.0 (Vekemans et al.,2002)軟件計算每個居群的多態位點數, 多態位點百分率(P),并計算居群、物種水平的遺傳多樣性(He)(Nei, 1978)[5]Jaccard 相似系數為參數用NTSYSpc 2.0 (Rohlf ,1994)[6]40個烏拉爾甘草樣品用非加權配對算術平均的方法(Unweighted pair-group method with arithmetic mean , UPGMA) 進行聚類分析。

2   

2.1 AFLP分析的引物篩選及其標記的多態性

由此對Eco RI標記引物E-AACE-AAGE-ACAE-ACTE-ACCE-ACGE-AGCE-AGG(8)Mse I 標記引物M-AAM-ACM-AGM-ATM-TAM-TCM-TGM-TT(8)完全排列組成的64對引物組合進行篩選,從中選出了15譜帶清晰、帶型分布均勻并且多態性高的引物組合,共擴增出2001條帶譜,平均每個引物擴增出133條。15, 對引物共擴增出多態性帶1030條,多態位點百分率為51.47% (1)

 1 適宜于甘草屬AFLP分析的15個引物組合序列及其擴增結果

Table 1 The base sequence of 15 primer combinations for AFLP analysis; and AFLPs generated among 50 individuals using the 15 combinations

引物組合

Primer combination

引物序列

Prime sequence(5-3)

總位點數

Total bands

多態位點數

Polymorphic bands

多態位點百分率P

Polymorphism( %)

E-AAC/M-CAA

GACTGCGTACCAATTCAAAC

GATGAGTCCTGAGTAACAA

134

72

53.7

E-AAC/M-CAC

GACTGCGTACCAATTCAAAC

GATGAGTCCTGAGTAACAC

169

86

50.9

E-AAC/M-CAG

GACTGCGTACCAATTCAAAC

GATGAGTCCTGAGTAACAG

119

62

52.1

E-AAC/M-CAT

GACTGCGTACCAATTCAAAC

GATGAGTCC TGAGTAACAT

126

66

52.4

E-AAC/M-CTC

GACTGCGTACCAATTCAAAC GATGAGTCCTGAGTAACTC

118

58

49.2

E-AAC/M-CTG

GACTGCGTACCAATTCAAAC GATGAGTCCTGAGTAACTG

136

71

52.2

E-AAC/M-CTT

GACTGCGTACCAATTCAAAC GATGAGTCCTGAGTAACTT

128

69

53.9

E-AAG/M-CAA

GACTGCGTACCAATTCAAAG GATGAGTCCTGAGTAACAA

146

61

41.8

E-AAG/M- CAC

GACTGCGTACCAATTCAAAG GATGAGTCCTGAGTAACAC

150

80

53.3

E-AAG/M- CAG

GACTGCGTACCAATTCAAAG GATGAGTCCTGAGTAACAG

124

63

50.8

E-AAG/M-CTC

GACTGCGTACCAATTCAAAG GATGAGTCCTGAGTAACTC

111

60

54.1

E-AGG/M-CAA

GACTGCGTACCAATTCAAGG GATGAGTCCTGAGTAACAA

140

77

55

E-AGG/M-CAG

GACTGCGTACCAATTCAAGG GATGAGTCCTGAGTAACAG

138

64

46.4

E-AGG/M-CTG

GACTGCGTACCAATTCAAGG GATGAGTCCTGAGTAACTG

120

65

54.2

E-AGG/M-CTT

GACTGCGTACCAATTCAAGG GATGAGTCCTGAGTAACTT

142

76

53.5

總計/平均

 

2001/134

1030/67.5

--/51.47

 2.2 甘草屬植物遺傳多樣性分析

   甘草屬五種不同來源的植物的多態位點數在65~74之間,多態位點百分率從46.8%(脹果甘草)到56.6%(光果甘草)不等(表2);而烏拉爾甘草不同栽培品系的多態位點數以內蒙古對照最高,“阿勒泰1號”次之,“烏什1號”最低,多態位點百分比率分別為55.2%53.4%48.3%

甘草屬五種不同來源的植物的遺傳多樣性在0.16730.1986之間,其中光果甘草的遺傳多樣性最大(0.1986),遺傳多樣性最小的是脹果甘草(0.1673),屬內的平均遺傳多樣性Hep=0.1864。對于烏拉爾甘草各栽培品系的遺傳多樣性以內蒙古對照(0.1982)最高,“阿勒泰1號”(0.1893)次之,“烏什1號”(0.1784)最低(表2)。

2 甘草屬五種不同來源植物的遺傳多樣性分析

Table 2 Genetic diversity within different species of Glycyrrhiza

品種

Population

樣品數

Number of sample

多態位點數

Polymorphic sites

多態位點百分率

PPB(%)

基因多樣性(He)

Gene diversity

標準差

Standard error

內蒙古Neimongo

10

72

55.2

0.1982

0.01646

阿勒泰1

Aletai No.1

10

70

53.4

0.1893

0.01501

烏什1

Wushi No.1

10

68

48.3

0.1784

0.01432

脹果甘草

Glycyrrhiza inflata

10

65

46.8

0.1673

0.01605

光果甘草

Glycyrrhiza glabra

10

74

56.6

0.1986

0.01732

平均

Population

10

66.5

53.2

0.1864

-

注:PPB=Percentage of polymorphic sites

 2.2 指紋圖譜構建

在篩選出的15對引物組合中,E-AGG/M-CAA組合共擴增出140條帶譜,擴增的DNA片段在50bp~450bp之間,其中多態性帶譜為77條,共有帶43條,多態位點百分率達到了55%,為各引物中最高。特異性譜帶12條,其中“阿勒泰1號”分別在82bp,90bp,116bp,295bp,330bp個位點處有區別于內蒙古烏拉爾甘草的特征譜帶,“烏什1號”具有的特異性譜帶數分別為2條(310bp,430bp),而光果甘草與內蒙古烏拉爾甘草相比較在102bp,165bp, 291bp, 330bp,350bp五個位點處具有特征譜帶,脹果甘草則具有3條特征譜帶(85bp, 98bp, 210bp)。因此,該引物組合具有較強的檢測甘草屬不同來源植物的基因型間遺傳變異差異性的能力,用以構建指紋圖譜(1)
 

 
1:內蒙古對照, 2:阿勒泰1, 3:烏什1, 4:脹果甘草, 5:光果甘草

1: Inner Mongolia, 2:Aletai No.1, 3:Wushi No.1, 4:Glycyrrhiza inflata, 5:Glycyrrhiza glabra

1 基于E-AGG/M-CAA引物組合的甘草屬植物的AFLP指紋圖譜

Fig.1 AFLP fingerprinting amplified with primer E-AGG/M-CAA

2.3 聚類分析

依據以上15對引物所擴增出的甘草屬的不同植物的2001DNA帶譜的數據,按照Jaccard 相似性系數進行UPGMA聚類,構建供試材料間的親緣關系樹狀圖(圖2)。

由圖2可以看出,所研究的甘草屬的植物被聚為兩組。其中,內蒙古對照與光果甘草聚為一組;“烏什1號”、“阿勒泰1號”與脹果甘草被聚為一組,在0.60處脹果甘草被分離出。結果表明,內蒙古烏拉爾甘草和光果甘草之間親緣關系最近;烏拉爾甘草栽培新品系“阿勒泰1號”與“烏什1號”之間的親緣關系也較近,而脹果甘草與其余種的親緣關系較遠。

c1:內蒙古對照; c2:阿勒泰1號; c3:烏什1號; c4:脹果甘草;c5:光果甘草

c1: Inner Mongoliac2: Aletai No.1 c3:Wushi No.1 c4: Glycyrrhiza inflata c5:Glycyrrhiza glabra

2 基于AFLP 數據的甘草屬五種不同來源植物UPGMA 聚類圖

Fig. 2 Dendrogram illustrating the genetic relationships among Glycyrrhiza accessions based on UPGMA cluster analysis of AFLP data

3   

新疆天山南北及塔克拉瑪干沙漠周邊地區是甘草屬植物的發源地,該地區氣候條件惡劣,沙塵暴頻繁,晝夜溫差大,蘊藏著豐富的甘草屬植物資源。烏拉爾甘草、光果甘草、脹果甘草同時長期生長在該地區,它們之間一定存在著某種親緣關系,并產生某種程度的變異,而這種變異正是我們進行甘草新品系選育的基礎。

“阿勒泰1號”、“烏什1號”分別采集于新疆的阿勒泰地區、烏什縣的野生種群,經連續七年的大面積引種栽培,發現與常規人工栽培品系內蒙古產烏拉爾甘草相比,在單位面積產量、株型、抗性、產品品質等方面具有顯著的優勢,目前正大面積推廣累積超過4000公頃

分析結果表明,光果甘草與內蒙古產烏拉爾甘草親緣關系最近,而脹果甘草距離二者較遠,由此看來,內蒙古產烏拉爾甘草與光果甘草、脹果甘草存在某種進化關系,烏拉爾甘草有可能經過數百萬年的演化變異,進化到光果甘草。該推論有待進一步研究。

 References

[1]  Zhou C M, Xu B, Zhang J T, Gao W Y. Study on Selective Breeding of Glycyrrhiza uralensis (Ⅰ)[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs(中草藥).2007, 38(7):1078~1081

[2]  Vos P, Hogers R, Bleeker M, et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting[J]. Nucleic Acids Research, 1995,23(21):4407-4414

[3]  Sun Q L, Liang Y R, Ding Z T, et al. AFLP molecular marker technique and its application to tea Genetic and breeding research[J]. Journal of Tea(茶葉),2004,30(4):203-206

[4]  Doyle J J, Doyle J L. Isolation of plant DNA from fresh tissue [J] . Focus, 1990, 12 (1): 13 -15

[5]  Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals[J]. Genetics , 1978, 89 , 583- 590 .

[6]  Rohlf FJ. NTSYS- pc, Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System Version 2. 0. Exeter Software[M] , Setauket , New York. 1994



[1]收稿日期:

基金項目: 國家自然科學基金“衛星搭載甘草種質選育的研究”,編號30472148

通訊作者: 庾曉紅,博士,daning5339@sohu.com010-6125988615901208830



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